荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法

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荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法

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荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法

荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法

荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法
独特的PCR优化体系,使2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR具有更强的兼容性。
热启动Foregene Taq Polymerase,具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。
优化的2× Real PCR EasyTM Mix使SYBR Green I具有更高的检测灵敏性,其荧光强度为同类产品的3-5倍,可满足不同类型的荧光定量实验需求。
本产品附带有ROX内参染料,可用于消除信号本底及孔间信号误差,方便客户用于不同型号定量PCR仪使用。

试剂盒内容
2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR:包含福际生物特别改造的热启动Taq DNA Polymerase、MgCl2、优化配比的dNTPs和SYBR Green I、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。PCR反应时,只需将适当的裂解混合液、引物、DNase-ddH2O添加到2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR中即可用于PCR反应。

ROX Reference Dye:一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上,用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同,用户可以根据仪器的推荐浓度添加。

DNase-Free ddH2O:超纯水,用于

试剂盒原理

试剂盒使用了热启动Foregene Taq DNA Polymerase进行PCR扩增,通过检测反应液中SYBRGreen I的荧光强度,达到监控PCR产物扩增量的目的。在PCR反应体系中,加入过量SYBRGreen I荧光染料,SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBRGreen I染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I与双链DNA结合后发出荧光,可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度,达到检测PCR产物扩增量的目的

 

Real Time PCR引物设计原则

Forward Primer和Reverse Primer
进行Real TimePCR,引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等,可以参照以下原则进行引物设计:

u  引物长度:18-30bp。

u  GC含量:40-60%。

u  Tm值:引物设计软件,如Primer 5,可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应    尽量接近。也可以使用Tm计算公式:Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时,一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度(相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性)。

u  引物及PCR产物:

v  设计引物PCR扩增产物长度最好在100-150bp。

v  应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。

v  避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。

v  引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。

v  引物自身不能存在互补结构,否则会形成发夹结构,影响PCR扩增。

v  引物序列中ATCG应尽量分布均匀,3’端碱基避免为T。

Probe

探针选择要保守,引物选择要保守,因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时,必须确保探针的片段是保守的。一般按照以下原则进行Probe的设计:

u  探针位置尽可能地靠近上游引物。

u  探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性。

u  检测探针的DNA折叠和二级结构。

u  Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%。

u  探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5’G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

u  整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。

u  为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。


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